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Development of a method for wild boar (Sus scrofa) population size estimation by genotyping of non-invasive samples

Entwicklung einer Methode zur Populationsschätzung von Wildschweinen (Sus scrofa) mittels Genotypisierung nicht-invasiv gewonnener Proben

  • Wild boars belong to the most wide spread ungulates in the world. They are characterized by a well performed adaption to their environment mainly due to their omnivorous dietary. The wild boar population in Germany increased during the past three decades. Nowadays their high density leads to problems in agricultural areas due to damage of crops and plays a significant role as disease vector as the classical swine fever. For an effective population management population size information is of crucial importance. Different traditional methods exist to estimate population sizes as direct sightnings, faecal drop counts or hunting harvest which provide only relative estimates and population trends. Absolute population sizes could be yielded by a Capture-Mark-Recapture (CMR) approach. However, capturing of wild boars is difficult to realize and costly in terms of personnel and field effort. Furthermore the capture probabilities are heterogeneous due to the variable behaviour of individuals influenced by age, sex, and experience of the animals. Non-invasive genetic methods are a promising complement to the traditional methods for population size estimation particularly for wild boar. These methods reduce stress and capture bias and increase the number of re-captures. Faeces proved to be a suitable DNA source for wild boar genotyping, due to almost equal capture probability. However working with faeces implicates difficulties such as low DNA rnquality and quantity, genotyping errors as dropout and false alleles. The main aim of the present study was to develop a reliable, cost-efficient, reproducible and practicable method for wild boar genotyping. This method should provide a reliable dataset of genotypes obtained from the collected faeces samples. Individual identification forms the basis for an improved mark-recapture approach. As there is no sound method for absolute population counts in free living wild boar, reference values for the validation of this new approach are missing. Therefore, different routines to reduce and to assess genotyping errors were compared within this thesis. For maximum amplification rate, the storage, the extraction methods and the PCR-procedure were optimised. A step by step procedure was evaluated in order to determine the minimum required microsatellite (MS) number for reliable individual identification including a test with family groups (female and embryo tissue) to distinguish even between close relatives. A multiple-tubes approach, post-amplification checking and different correction procedures were applied to reduce genotyping errors. In order to quantify real genotyping error rates (GER) of datasets derived from sampling in the Palatinate Forest in western Germany, different methods for GER determination were compared with each other, obtaining GERs between 0% and 57.5%. As a consequence, more strict criteria for the multi-tube approach and increased repetition number of homozygous samples were used. An additional method validation was the implementation of a blind test to achieve the reliability of the genotyping and error checking procedure. Finally a strict and practicable proposal for the lab procedure was developed, by beginning with faecal sample collection and ending with a reliable dataset with genotypes of each sample. The results of the presented method were derived from two sampling periods in a 4000 ha area in the Palatinate Forest in Rhineland-Palatinate in December 2006 and 2007. Both provided high confidence intervals (CI) applying inaccurate estimates (eg. for 2006 population size amounted to 215 with CI 95% of 156-314 and for 2007 population size amounted to 415 with CI 95% of 318-561) due to low sampling sizes (for 2006 n = 141 and for 2007 n = 326), successfully analysed samples (for 2006 n = 89 and for 2007 n = 156) and recapture numbers (for 2006 n = 12 and for 2007 n = 24). Furthermore, the population estimates even for the lowest values were considerably higher than previously assumed by hunting statistics, which implicates an ineffective hunting regime in the study area. For the future prospect, to obtain more precise population size estimations the increase of sampling sizes is inevitable, because absolute and reliable estimates are highly desirable for wildlife management and the control of diseases transmission. Nevertheless, the method for individual genotyping of wild boars evaluated in this thesis could be successfully established resulting in reliable datasets for population estimation modelling with sufficiently low GER.
  • Wildschweine gehören zu den meist verbreiteten Huftieren der Welt. Die Wildschweinpopulation in Deutschland stieg in den letzten drei Jahrzehnten deutlich an. Heutzutage führt deren hohe Dichte zu Schäden auf landwirtschaftlichen Flächen und spielt eine wichtige Rolle bei der Ausbreitung von Krankheiten. Für ein effektives Wildschwein Management sind Informationen über absolute Populationszahlen von höchster Bedeutung. Es existieren verschiedene traditionelle Methoden wie z.B. die direkte Beobachtung der Tiere, das Zählen ihrer Losungen oder die Auswertung der Statistiken zu Jagderträgen, die nur relative Schätzungen oder Populationstrends liefern. Absolute Populationszahlen könnte der Fang-Markier-Wiederfang Ansatz hervorbringen. Nichtsdestotrotz ist das Fangen von Wildschweinen schwer zu realisieren und kostenaufwendig in Bezug auf die hierzu benötigten Arbeitskräfte und den Feldarbeitsaufwand. Weiterhin sind die Fangwahrscheinlichkeiten heterogen aufgrund der Verhaltensvariabilitaet der Individuen, die durch Alter, Geschlecht und Erfahrung der Tiere bedingt ist. Nicht-invasive genetische Verfahren sind vielversprechender gegenüber den traditionellen Methoden der Populationsgrößenschätzung speziell für Wildschweine. Denn zum Einen reduzieren diese Methoden den Stressfaktor der Tiere und senken Fangfehler und zum Anderen erhöhen sie die Zahl indirekter Beobachtungen. Kot eignet sich sehr gut als DNS-Quelle für die Wildschwein Genotypisierung, da dieser eine nahezu gleiche Erfassungswahrscheinlichkeit für alle Tiere gewährleistet. Nichtsdestotrotz bringt das Arbeiten mit Kot Schwierigkeiten mit sich, die sich in in einer geringen DNS Qualität und Quantität oder Genotypisierungsfehlern äußern. Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer zuverlässigen, kostengünstigen, reproduzierbaren und praktikablen Methode zur Genotypisierung von Wildschweinen. Diese Methode sollte einen zuverlässigen Genotypendatensatz liefern, der aus der Genotypisierung gesammelter Kotproben stammte. Individuelle Identifikation bildet die Basis für einen anzuwendenden Fang-Markierung-Wiederfang Ansatz. Da es bisher keine vergleichbaren Untersuchungen zu Populationsschätzungen von Wildscheinen gibt, fehlen Referenzdaten zum nicht-invasiven Ansatz. Daher wurden verschiedene Versuche zur Reduzierung und Quantifizierung der Genotypisierungsfehlerraten (GFR) getestet, verglichen und evaluiert. Um die Amplifizierungsrate zu erhöhen wurden Hälterungs- und DNS-Isolationsverfahre optimiert. Ein Schritt für Schritt Ansatz zur Bestimmung der minimal erforderlichen Anzahl von Mikrosatelliten Marker wurde entwickelt, welcher einen Test mit nahverwandten Individuen (Mütter und deren Föten) beinhaltete, um sogar diese voneinander zu unterscheiden. Ein so genanntes Multitube-Verfahren wurden angewendet um die GFR zu reduzieren. Die Quantifizierung von GFR aus erhobenen Datensätzen wurde evaluiert indem verschiedene Methoden zur GFR-Bestimmung getestet und miteinander verglichen wurden, hierbei ergaben sich GFR zwischen 0% bis 54%. Als Konsequenz dessen wurden die Kriterien für das Multitube-Verfahren verschärft, indem die Anzahl der Wiederholungen von homozygoten Proben erhöht wurde. Eine zusätzliche Validierung in Form eines Blindtests wurde etabliert, um die Zuverlässigkeit der Genotypisierung und Fehlerkorrekturen zu bekräftigen. Abschließend wurde ein strikter und praktikabler Verfahrenvorschlag entwickelt, beginnend beim Sammeln der Kotproben und endend mit dem Erhalt eines zuverlässigen Datensatzes mit Genotypen einzelner Proben. Die Ergebnisse der hier präsentierten Methode aus zwei Beprobungen 2006 und 2007 in einem 4000 ha großen Areal im Pfälzer Wald führte zu ungenauen Schätzungen mit hohen Konfidenzintervallen (KI). So lag die geschätzte Populationsgrösse in der Beprobung 2006 bei 215 Individuen, was 156-314 (KI 95%) Individuen entspricht. Die Populationsschätzung 2007 brachte 415 Individuen hervor, was 315-561 (KI 95%) Individuen entspricht. Dies ließ auf zu niedrige Stichproben (2006 betrug n = 141, 2007 n = 326), zu wenig erfolgreich analysierte Proben (2006 n = 89, 2007 n = 156) und/ oder zu wenig Wiederfänge (2006 n = 12, 2007 n = 24) schließen. Zudem ergaben die Schätzungen sogar deutlich höhere Populationszahlen als zuvor durch Jagderträge vermutet wurde, was auf eine uneffektive Bejagungsstrategie in dem Studienareal hindeutet. Für den zukünftigen Ausblick ist es unabdingbar die Stichprobenzahl deutlich zu erhöhen um die Validität und Reliabiltät der Populationsschätzungen zu gewährleisten, da diese für das Wildmanagement und die epidemiologischen Lösungsstrategien von höchster Bedeutung sind. Nichtsdestotrotz konnte die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Methode zur individuellen Wildschwein Genotypisierung erfolgreich etabliert werden. Die daraus resultierenden Datensets zur Modellierung von Populationschätzungen sind zuverlässig und weisen eine ausreichend geringe reale Genotypisierungsfehlerrate auf.

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Metadaten
Author:Karolina Kolodziej
URN:urn:nbn:de:hbz:lan1-8371
Advisor:Ralf Schulz
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of completion:2012/11/09
Date of publication:2012/11/09
Publishing institution:Universität Koblenz-Landau, Campus Landau, Universitätsbibliothek
Granting institution:Universität Koblenz-Landau, Campus Landau, Fachbereich 7
Date of final exam:2012/10/25
Release Date:2012/11/09
Tag:genotyping error; microsatellite analysis; population genetics; wildlife management
GND Keyword:Genetischer Fingerabdruck; Populationsgenetik; Wildtiere
Number of pages:IV, 104
Institutes:Fachbereich 7 / Fachbereich 7
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
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