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Nanotemplates for the combined structural and functional analysis of membrane-associated proteins

  • Plasma membranes are essential for life because they give cells an identity. Plasma membranes are almost impermeable to fluids and substances. Still, transport between inside and outside needs to be possible. An important transport way is endocytosis. This mechanism relies on membrane-associated proteins that sense and induce curvature to the plasma membrane. However, the physics and structural dynamics behind proteins acting on membranes is not well understood. There is a standard method in vitro to investigate membrane-associated proteins sensing spherical geometries: They are incubated on unilamellar vesicles. This procedure allows to analyze these proteins in their bound state. This approach is inappropriate for GRAF1 (GTPase Regulator Associated with Focal Adhesion Kinase-1), a key player in endocytosis because it senses tubular geometries instead. However, GRAF1 extrudes lipid tubes from vesicles that can be analyzed. Still, this is a limited method because these tubes suffer from inhomogeneity and they do not enable the observation of intermediate and lower concentration binding states. To overcome this issue they can be incubated on pre-tubular structures called nanotemplates. There have been studies using carbon nanotubes and Galactosylceramide lipid tubes as nanotemplates. These approaches require complex chemical modifications or expensive components and they are not necessarily flexible. In this work we present a simple and easy new approach to prepare nanotemplates using Folch lipid mixture. We show on the basis of BPG, a truncate of GRAF1, that our nanotemplates are suitable for Cryo-EM and that it is possible to use IHRSR (Iterative Helical Real Space Reconstruction) to analyze the structure of BPG in its bound state. Moreover, the qualification for Cryo-EM allows to use plunge freezing to interrupt the incubation on our nanotemplates abruptly. This enables the analysis of intermediate binding states to understand the binding process.
  • Die Inkubation von unilamellaren Lipid-Vesikeln mit einem als BPG bezeichneten Abschnitt des Proteins GRAF1 führte zur Entstehung von röhrenförmigen Strukturen. Eine Untersuchung mittels negativkontrastierter Elektronenmikroskopie zeigte eine körnige Beschichtung auf der Röhrenoberfläche. Durch die höhere Auflösung der Elektronentomographie war es möglich, helikale Oligomere auf den Röhren zu erkennen. Des Weiteren zeigte sich, dass die Röhren im Durchmesser inhomogen waren und Biegungen aufwiesen. Das hatte ebenfalls Unregelmäßigkeiten in der Ordnung der helikalen Struktur zur Folge. Das Herstellungsverfahren von unilamellaren Vesikeln mittels Extruder wurde so modifiziert, dass es anstatt von Vesikeln Nanoröhren entstehen ließ. Im Gegensatz zu den Röhren, die das Protein formte, wiesen diese eine lineare Struktur mit konstantem Durchmesser auf. Trotz der Inkubation mit BPG behielten diese ihre homogene Form und zeigten nun eine geordnete helikale Beschichtung auf ihrer Oberfläche. Allerdings waren sie nicht hoch genug konzentriert für die Kryoelektronenmikroskopie, und eine reine Erhöhung der Lipidkonzentration führte nicht zu einer höhren Anzahl von Röhren, sondern zu Lipidaggregation. Weitere Experimente zeigten, dass die Chelatliganden EDTA und EGTA in der Pufferlösung zur Entstehung unilamellarer Vesikel führten. Da EDTA und EGTA die Metallionen Mg2+ und Ca2+ absorbieren, wurden weitere Tests mit neuen Pufferlösungen durchgeführt. Zur Absorption bereits vorhandener Metallionen wurden beide Chelatliganden hinzugegeben und eine Variante mit zusätzlichem Magnesiumchlorid und eine weitere mit zusätzlichem Calciumchlorid hergestellt. Es wurde gezeigt, dass Magnesiumchlorid unilamellare Vesikel zur Folge hatte und Calciumchlorid zu einer höhren Konzentration der Nanoröhren führte. Daraus wurde geschlossen, dass Calciumionen die Enstehung von Nanoröhren fördern. Zur weiteren Optimierung der Konzentration wurde eine Varianzanalyse (CCD) der einflussreichsten Variablen im Extrusionsprozess durchgeführt: - Eine höhere Anzahl von Frier-Tau-Zyklen zur Unterdrückung multilamellarer Vesikel hatte einen positiven Einfluss. - Es konnte keine Korrelation zwischen der Extrudertemperatur und der Konzentration von Nanoröhren nachgewiesen werden. - Mehr Extrusionszyklen hatten eine höhere Nanoröhrenkonzentration zur Folge. Durch das optimierte Protokoll war die Konzentration hoch genug für die Kryoelektronenmikroskopie und eine helikale Rekonstruktion. Dennoch war eine 2D-Klassifizierung nicht erfolgreich, da die Nanoröhren im aufgenommenen Datensatz nicht homogen genug im Durchmesser waren und zudem eine unterschiedliche Anzahl an multilamellaren Rändern aufwiesen. Aus diesem Grund wurde ein Skript entwickelt, das die Röhren nach ihrem Durchmesser sortiert. Mit einer Untermenge des Datensatzes, dessen Röhren einen ähnlichen Durchmesser hatten, wurde eine weitere 2D-Klassifizierung durchgeführt. Daraus resultierten schließlich 2D-Klassen der helikalen Oberflächenstruktur.

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Metadaten
Author:Nikolai Krupp
URN:urn:nbn:de:kola-17933
Referee:Barbara Hahn, Elmar Behrmann
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of completion:2019/02/14
Date of publication:2019/02/14
Publishing institution:Universität Koblenz-Landau, Universitätsbibliothek
Granting institution:Universität Koblenz-Landau, Campus Koblenz, Fachbereich 3
Date of final exam:2019/02/08
Release Date:2019/02/14
Tag:Calcium; Elektronenmikroskopie; GRAF1; Kryo; Nanoröhren; Oligomer; Proteinstrukturanalyse
Number of pages:xi, 120
Institutes:Fachbereich 3 / Institut für Integrierte Naturwissenschaften / Institut für Integrierte Naturwissenschaften, Abt. Physik
Licence (German):License LogoEs gilt das deutsche Urheberrecht: § 53 UrhG